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            核酸分離純化技術是生物化學與分子生物學的一項技術

            更新時間:2021-11-11  |  點擊率:1418
              核酸分離純化技術是生物化學與分子生物學的一項基本技術。隨著分子生物學技術廣泛應用于生物學、醫學及其相關等領域,核酸的分離與純化技術也得到進一步發展。各種新方法、經完善后的傳統經典方法以及商品試劑方法的不斷出現,極大地推動了分子生物學的發展?,F就核酸分離與純化的原理及其方法學進展作一綜述。
             
              核酸分離與純化的原則
             
              核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。在分離核酸時應遵循以下原則:保證核酸分子一級結構的完整性;排除其他分子污染。
             
              核酸分離與純化的步驟
             
              大多數核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。
             
              1.細胞裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。
             
              (1)機械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,但機械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從<500bp~>20kb之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般<10kb。
             
              (2)化學作用:在一定的pH環境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑或強離子劑而獲得。
             
              而pH環境則由加入的強堿或緩沖液提供。在一定的pH環境下,表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+、Ca2+,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。
             
              (3)酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶)以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質,促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1,4)鍵水解。
             
              蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65℃及有EDTA、尿素和去污劑存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細胞類型、待分離的核酸類型及后續實驗目的來確定。
             
              2.酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當的酶使不需要的物質降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質,滅活核酸酶,DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。




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